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t4连接载体和片段比例
如何确定插入
片段
的用量和质粒
载体
的量
答:
一般参考T4连接酶的说明书,
大多数人做的是插入片段:载体=3:1至5:1
,是分子数的比值。可以先测出两者的质量浓度(分光光度计或者跑电泳),然后根据分子量大小可以算出。
用
T4连接
酶做
载体连接
为什么一直连不上
视频时间 1:10
请教,关于KPn1高温灭活纯化和
T4连接
酶体系的生化问题
答:
自己回答:现在
连接
的体系应该是没什么问题,可能是双酶切的时候没有完全把位点切开,毕竟两种酶在共用buffer的情况下存在竞争,虽然之前做过交叉试验验证了可行性。目前的计划是分别单酶切后纯化,保证能切开。 我们采用的摩尔比是
片段
:
载体
=3:1,理论是可行的,
T4
ligase的效率是可信的。总之,还要...
t4连接
酶连接体系怎么计算
答:
最适克隆
载体
/插入
片段
摩尔比。经查询
t4连接
酶连接体系的相关资料得知,t4连接酶连接体系计算公式为最适克隆载体/插入片段摩尔比。T4-DNA连接酶即T4DNA连接酶,可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合。
急!平末端
连接
问题
答:
你用的是T4连接酶吧?平末端连接,一定要用大量的目的片段去竞争载体自连,
一般要保证你的片段和你的载体的摩尔数目之比要达到8:1以上才能达到比较高的连接效率
。10微升体系中,一般T4连接酶都是用0.5微升的。然后你按照10:1摩尔比加入你的片段和载体就行了,用水补足体积。此外,还有一点,平末端...
聚合酶链式反应的克隆PCR产物
答:
1:1(插入
片段
:
载体
)常为最佳比,摩尔数比1:8或8:1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液,50ng质粒DNA,1Weiss单位的
T4连接
酶,插入片段共10ul。室温保温1小时,或4℃过夜。在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求,为提高连接效率,需4℃过夜。2)PCR产物...
问一个分子生物学的问题,
片段连接
答:
1.
片段
略长了些,增加了
连接
的难度,建议连接时控制一下
载体和
片断的摩尔
比例
1:3~1:10,载体的量尽量少些。2.你的片段如果是PCR产物双酶切后用于连接,建议酶切时间长一些,以保证能完全切开,也就是说你得连接过程要保证没有问题。3.如果一种感受态菌株不行的话,建议你试试其它菌株。4.你得...
【求助/交流】请问大家:将外源DNA
与载体连接
的体系怎么确定啊?_百度...
答:
3-1:8都可以,宝生物的一般
T4
DNA
连接
酶最好16度过夜连接,转化时加5微升即可。nuoyaeva(站内联系TA)...比如我用的Invitrogen的试剂盒,他给出的最佳mol比是10:1,然后你你根据你
片段和载体
的核苷酸数,算出你要加的ng数(根据说明书里的公式),再根据你片段的浓度算出体积数 然后拍照。。
T4连接
后对其质粒PCR条带不亮,为什么?酶切没有条带,是否连接上?
答:
很显然你的质粒没有构建成功。感觉是
连接
出了问题,pBI121
载体
很大,回收比较困难,建议你测一下回收后的浓度。如果太低的话,建议加大酶切量。121载体至少应该达到50-100ng,然后再按1:3-10摩尔比加入小
片段
.至于PCR验证出现假阳性,太正常了。还是酶切比较靠谱。
载体
构建摩尔比怎么算
答:
载体除了质粒以外,还有噬菌体载体、病毒载体等.问题二:
连接
时
载体和片段
的摩尔比多少合适 跑胶估计就是用你的样品,和DNA marker中已知量的条带的亮度
比例
,来估算你的样品的DNA样品。这个需要一定的经验。例如一般的1KB ladder,最亮的条带在点样3微升时为50ng,那么你看你的条带的亮度大约是ladder...
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