故事始于圆明园的深夜，一宫女在太医曹太虚的掩护下，对雍正的寝宫实施了偷袭，导致雍正暴毙，人头神秘失踪，下葬时用一颗金头代替。乾隆即位后，迅速秘密调查此案，怀疑吕留良家族的唯一幸存者吕四娘可能是凶手。吕四娘在文字狱后被独臂神尼收养，习得一身武艺，成为追捕目标。
乾隆严令“雍正无头案”不得泄露，并派遣内廷四大侍卫之一的伊尔根南下追捕。此时，吕四娘与曹太虚在南方小城行医卖艺。乾隆派特使带着龙牌至南少林，要求寺方调查二人行踪。南少林正举行三十六房主持竞选，胜者将执掌武功，寺内方世玉与云明呼声最高。
特使提出，胜者将持龙牌执行任务。但玄通大师考虑到比武规则，决定二人仅比试南拳七十二式，点到为止。云明企图在比赛中陷害世玉，为自己谋得主持之位。方世玉则与江湖老千卓灵和神偷赵大宏一同出发，追查吕四娘。他们的恩师三德和尚暗中保护，以防藏宝图落入他人之手。
云明和泉州知府温荣玉联手，欲利用世玉背上的藏宝图。吕四娘与世玉相遇，两人虽有过交手，却渐生情愫。伊尔根和四大侍卫在途中发现南少林弟子卷入，但世玉持有龙牌让追捕变得复杂。乾隆许以重赏，悬赏捉拿吕四娘与曹太虚。吕四娘与曹太虚在海宁行刺乾隆失败，被世玉保护并疗伤。
吕四娘自首后，得知世玉被乾隆囚禁，愤怒之下救出他并逃往广东。南少林面临乾隆的严厉威胁，云明自封主持，企图独占功劳。在一系列事件中，世玉和吕四娘的感情加深，最终决定离开南少林，共同生活。云明被吕四娘击败后，南少林危机解除，但世玉和吕四娘的命运仍充满变数。
《南少林三十六房》出炉袁咏仪吴京跨时空恋爱 。 《南少林三十六房》根据清代民间传说改编而成，剧中袁咏仪扮演的吕四娘与吴京扮演的方世玉，因为雍正被刺案而牵连在一起，日久生情撞击出火花。这是香港艺人袁咏仪签约内地后的首部电视剧。