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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第42卷 第12期 2011年12月
银杏叶滴丸中萜类内酯测定方法的改进研究
黄琴伟，李樱红，郑 成*
浙江省食品药品检验所，浙江 杭州 310004
摘 要：目的 以银杏叶对照提取物为对照建立银杏叶滴丸中萜类内酯的定量测定方法。方法 采用HPLC-ELSD 法，色谱，流动相为甲醇-水（30∶70），体积流量0.8 mL/min，ELSD 检测器，漂移柱为Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm ）
管温度105 ℃，氮气体积流量3.0 L/min。结果 银杏内酯A 、银杏内酯B 、银杏内酯C 、白果内酯分别在1 672.2～10 033.2、1 026.4～6 158.4、527.8～3 166.8、2 200.8～13 204.8 ng呈良好的对数线性关系；银杏内酯A 、银杏内酯B 、银杏内酯C 、白果内酯及总萜类内酯的平均回收率分别为100.3%（RSD 2.5%）、108.1%（RSD 3.5%）、116.0%（RSD 4.9%）、90.4%（RSD 0.6%）及99.3%（RSD 1.1%）。结论 本方法简单易行、可控性强、重复性好，可用于银杏叶滴丸中萜类内酯的定量测定，并为中成药中多指标成分同时测定提供了有效的思路和解决方案。
关键词：银杏叶滴丸；萜类内酯；银杏叶提取物；银杏内酯A ；银杏内酯B ；银杏内酯C ；白果内酯 中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)12 - 2456 - 03
Improvement of assay on terpene lactones in Yinxingye Dropping Pill
HUANG Qin-wei, LI Ying-hong, ZHENG Cheng
Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310004, China
Key words: Yinxingye Dropping Pill; terpene lactones; gingko leaves extract; ginkgolide A; ginkgolide B; ginkgolide C; bilobalide
银杏叶滴丸为银杏叶提取物的新型制剂，具有活血化瘀、通络作用，用于瘀血阻络引起的胸痹心痛、中风、半身不遂、舌强语謇，冠心病稳定型心绞痛、脑梗死见上述症候者[1]。目前银杏叶滴丸为浙江万邦药业有限公司独家生产品种，标准收载于《中国药典》2010年版[2]。萜类内酯是银杏叶提取物的活性组分之一[3]。银杏萜类内酯可高选择性拮抗由PAF 诱导的血小板聚集，其中以银杏内酯B 作用最强，从而降低血液黏度，防止机体组织器官缺血、缺氧[4]。银杏萜类内酯通常以银杏内酯A 、银杏内酯B 、银杏内酯C 、白果内酯为对照建立HPLC-ELSD 定量测定方法[2, 5-7]，并以此4种对照品量的总和计。为简化操作并节省资源，本实验以银杏叶对照提取物为对照进行方法学考察，对原标准进行优化。 1 仪器与材料
Agilent 1200型系列高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）：包括G1311A 四元泵、G1322A 脱气
收稿日期：2011-07-12
基金项目：国家“十一五”科技支撑计划（2009ZX09308-004）
作者简介：黄琴伟（1983—），女，浙江温州人，硕士，主要从事药品质量分析。
Tel: [1**********] Fax: (0571)86459425 E-mail:
[email protected] *通讯作者 郑 成 Tel: (0571)86459414 E-mail:
[email protected] 机、G1329A 自动进样器、G1316A 柱温箱、Alltech 2000ES 蒸发光散射检测器。
白果内酯（BB ，批号110965-200404）、银杏内酯A （GA ，批号110862-200608）、银杏内酯B （GB ，批号110863-200508）、银杏内酯C （GC ，批号110864-200906）对照品均由中国药品生物制品检定所提供；银杏叶对照提取物（批号091004）由浙江康恩贝药业有限公司提供（已标化，含GA 26.78 mg/g、GB 16.44 mg/g、GC 8.45 mg/g、BB 35.25 mg/g）。醋酸乙酯、醋酸钠、盐酸均为分析纯；甲醇为色谱纯，水为重蒸水。银杏叶滴丸（批号100310、100311、100312、100209、100401、100402）由浙江万邦药业有限公司提供。 2 方法与结果 2.1 色谱条件
色谱柱为Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm ），流动相为甲醇-水（30∶70），体积流量
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第42卷 第12期 2011年12月
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0.8 mL/min，ELSD 检测器，漂移管温度105 ℃，氮气体积流量3.0 L/min。理论板数按BB 峰计算
1
1
不低于2 500；GA 峰与GB 峰的分离度大于1.5。色谱图见图1。
A B
1
3
2
4
3
2
4
C
3
2
4
t / min
1-BB 2-GC 3-GA 4-GB
0 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 30
图1 银杏叶对照提取物（A ）、银杏叶滴丸（B ）和混合对照品（C ）的HPLC 图 Fig. 1 HPLC chromatograms of ginkgo leaves extract control (A), Yinxingye Dropping Pill (B),
and mixed reference substance (C)
2.2 混合对照品溶液的制备
527.8～3 166.8、2 200.8～13 204.8 ng呈良好的对数线性关系。 2.6 精密度考察
精密吸取上述对照提取物溶液10 μL ，重复进样5次，记录峰面积，GA 、GB 、GC 、BB 峰面积的RSD 分别为0.2%、0.4%、0.5%、0.1%，表明仪器精密度良好。 2.7 稳定性试验
取批号100310样品制备供试品溶液，分别在0、4、10、16、24、30 h时注入色谱仪，记录GA 、GB 、GC 、BB 峰面积，结果GA 、GB 、GC 、BB 峰面积的RSD 分别为0.5%、1.2%、0.7%、0.2%，表明供试品溶液在30 h内稳定。 2.8 重现性试验
取批号100310样品约0.5 g，共6份，按供试品溶液制备方法操作，注入液相色谱仪，依法测定，结果总萜类内酯量的RSD 为2.3%，GA 、GB 、GC 、BB 的RSD 分别为2.4%、3.0%、2.8%、1.5%。 2.9 加样回收率试验
按供试品溶液制备方法，取同一批样品（批号100310）各约0.25 g，共6份，加入已标化的银杏叶对照提取物各约0.1 g，注入液相色谱仪，依法测定，计算回收率和RSD 。结果表明，GA 、GB 、GC 、BB 及萜类内酯的平均回收率分别为100.3%、108.1%、116.0%、90.4%、99.3%，RSD 分别为2.5%、3.5%、4.9%、0.6%、1.1%，回收率符合要求。 2.10 样品测定
取6批样品各约0.5 g，按供试品溶液制备方法操作，注入液相色谱仪，依法测定，参考《中国药
分别精密称取GA 、GB 、GC 、BB 对照品22.47、18.97、10.25、19.60 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。 2.3 供试品溶液的制备
取银杏叶滴丸20丸，研细，混匀，取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水20 mL、2%盐酸溶液4滴、醋酸乙酯20 mL，加热回流30 min；冷却至室温，转移至分液漏斗，分取醋酸乙酯液，水液再用醋酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并醋酸乙酯液，用5%醋酸钠溶液20 mL萃取，分取醋酸钠液，用醋酸乙酯20 mL萃取，合并醋酸乙酯液，用水洗涤2次，每次10 mL，分取水液，用醋酸乙酯20 mL提取，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.4 对照提取物溶液的制备
取已标化的银杏叶对照提取物0.15 g，精密称定，照供试品溶液的制备方法，同法制成对照提取物溶液。
2.5 线性关系考察
精密吸取上述对照提取物溶液2、4、6、8、10、12 μL ，分别注入高效液相色谱仪，以进样量的对数值为横坐标（X ），峰面积的对数值为纵坐标（Y ）进行线性回归，得回归方程：GA Y ＝1.249 X －2.721 5，r ＝0.999 2；GB Y ＝1.421 6 X －4.629 1，r ＝0.999 4；GC Y ＝1.646 2 X －3.687 3，r ＝0.999 6；BB Y ＝r ＝0.999 4；表明GA 、GB 、GC 、1.257 4 X －1.986 1，
BB 分别在1 672.2～10 033.2、1 026.4～6 158.4、
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第42卷 第12期 2011年12月
[1]典》萜类内酯的量以GA 、GB 、GC 和BB 总量计，
察了漂移管温度、氮气体积流量，结果表明漂移管温度为105 ℃、氮气体积流量为3.0 L/min，响应值最大。
本实验同时采用常规的混合对照品法测定了6批样品中总萜类内酯的量，经对比，两种测定方法所得结果的相对平均偏差依次为0.9%、0.8%、0.4%、1.3%、0.0%、1.2%。
本实验为使标准更加科学简便，对萜类内酯的结果见表1。
表1 银杏叶滴丸中总萜类内酯定量测定结果 (n ＝2)
Table 1 Determination of terpene lactones
in Yinxingye Dropping Pill (n = 2)
批 号
总萜类内酯/(mg·丸−1)
银杏叶对照提取物法
混合对照品法
100310 1.11 1.09 100311 1.17 1.19 100312 1.23 1.24 100209 1.20 1.17 100401 1.20 1.20
100402 1.25
1.28
3 讨论
参考《中国药典》2010年版[1]“加10 mL水，温热溶解”，结果发现有部分残渣不能完全溶解，故本实验考察了供试品溶液的提取条件，结果表明，20 mL，……，加醋酸乙酯20 mL，加热回流30 min”，可解决残渣难溶的问题，同时将每次醋酸乙酯的用量增至20 mL，可避免乳化。
本实验比较了正丙醇-四氢呋喃-水
[4-6]
和甲醇-
水[8-9]两种流动相系统，经试验，发现两种系统下4种银杏内酯均能在30 min内达到基线分离，考虑到正丙醇和四氢呋喃均为不常用的试剂，特别是四氢呋喃，毒性和刺激性均较大，综上考虑，故将流动相制定为甲醇-水（30∶70）。
本实验曾于25、30、40 ℃的柱温条件下考察了色谱峰的分离效果，结果各色谱峰均能有效分离；另考察了Diamonsil C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm ）、Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm ）、Kromasil 100-5 C18色谱柱250 mm×4.6 mm，5 μm ），结果3种色谱柱均适用于该分析方法，说明本方法有较好的耐用性。
本实验对蒸发光散射检测器参数进行优选，考
前处理方法和液相色谱流动相系统进行了改进；为节约对照品和化学试剂的用量，采用银杏叶对照提取物进行定量，为中成药中多指标同时的测定提供了有效的思路和解决方案，为节省中药对照品，降
低实际检验成本都有很大的益处。 参考文献
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“加水（