我想分享一篇2020年2月6日发在《Cell》的paper，“ Co-incidence of Damage and Microbial Patterns Controls Localized Immune Responses in Roots ”，一作是来自瑞士洛桑大学的周峰博士，硕博期间就特别优秀，师从万建民院士，克隆了水稻中抑制独脚金内脂激素信号的基因DWARF53，并对其功能进行了研究，调控矮化和多分蘖，相关工作发在《Nature》上，现已全职回国。我觉得本篇的亮点在于，一，创造性地采用一种新型的报告系统和细胞消融技术。二，借单细胞测序的东风，在单细胞水平完成植物根系对天然免疫响应的时空变化。三，机制扩充到多种PRR。四，根与根际有益(害)微生物。
文章回答了这样一个问题：拟南芥根系在面临损伤和病原菌侵染时，在单细胞水平如何激活下游的免疫响应。
对植物免疫响应来说，识别病原菌联系的分子模式(MAMPs)是至关重要的。这种复杂的感知系统不断地暴露在微生物群组中，如何有效地应用于根系仍然是个谜。通过观察拟南芥根系在细胞水平上MAMP受体的表达模式和响应水平，我们观察到，已分化细胞的外层展示了低水平的PRR(pattern-recognition receptors)表达，并且缺乏下游的MAMP响应。然而，这些细胞可以通过邻近细胞的损伤而产生反应。小细胞簇的激光消融能强烈地上调其邻近细胞的PRR表达，并且提高的PRR水平足够引起非响应细胞的免疫反应。最后，局部损伤也会导致对非免疫原性有益菌的免疫反应。损伤门控被受体过表达所覆盖，从而使病原菌无法在根际定植。我们的研究发现，细胞损伤可以“开启”局部免疫反应，这有助于理解细胞损伤是如何发生的，尽管土壤中存在微生物模式，但可以利用MAMP感知。
背景就简单介绍一下。如PTI的标志过程，如ROS的累积，MAPK的激活，其他Marker基因的表达。
材料：triple mVENUS fused to a nuclear localization signal (NLS-3xmVENUS)，荧光marker材料，可以在体内且在细胞水平分析MAMP的响应，
MAMP响应的marker基因：1.PER5 (PEROXIDASE 5)，受早期的MAMP诱导，且在根中高表达；2.WRKY11 (WRKY DNA-BINDING PROTEIN 11)；3.MYB51(MYB DOMAIN PROTEIN 51)；4.FRK1 (FLG22-INDUCED RECEPTOR-LIKE KINASE 1)。
flg22-Induced MAMP Responses Are Spatially Restricted in Arabidopsis Roots
从图1的ABC可得，四种marker基因中，在经过flg22处理根部后，PER5和FRK1背景噪音较低、诱导性较好，且MAMP响应的位置局限在分生区和伸长区。对于已分化的根部分，即使用高浓度的flg22处理，也不能观察到MAMP的响应信号。（红色是PI染色，绿色是荧光信号）
为了准确评估特定细胞和细胞类型的信号，作者产生了两种marker的遗传材料，另外一种是组成型表达且靶向质膜的RFP。作者在长期观察中发现，使用flag22处理后，在已分化的根中展示出减弱的，空间限制的MAMP响应，而在侧根形成过程中，侧根原基附近的细胞由于侧根原基的顶出遭到了破坏，此时施加flg22，侧根原基邻近细胞展示出对MAMP处理较强的响应（1D，1F，蓝色箭头表示侧根原基形成点，虚线圈表示侧根原基的形成，白色箭头表示MAMP响应）并且，当有自发的、非诱导性的细胞死亡时(1E*位置)，在邻近的细胞发现了flg22诱导的MAMP响应，并且这种响应是与受体(FLS2)有关的(1G)。因此，已分化的根有能力对MAMPs作出反应，这种反应被一种高度局部化的方式(侧根原基形成，自发性细胞死亡)诱导。
Laser-Induced Cell Ablation Causes Localized MAMP Responsiveness in Roots
(F2A白色星号代表激光消融的细胞，均在已分化的根操作,EP表皮,Co皮层,En内皮层,St中柱细胞)
使用激光消融破坏了不同类型的根部细胞后，我们只在邻近细胞观察到了强烈的flg22响应增加。而对于被消融的细胞本身，导致了没有或极少的MAMP marker基因的诱导，揭示了本身的细胞破坏并不足以去引起强有力的MAMP的响应。在表皮，皮层和内皮层都被消融后，中柱细胞较强地响应flag22的诱导，然而表皮细胞的消融并不会造成其表皮邻近细胞对flag22的响应(F2AB)。
早先我们知道，土壤中的有益微生物会定植在跟的伸长区，使用高剂量(1um)的flg22处理伸长区(F1B)也就模拟了这种过程，不需要damage就能造成MAMP响应。为了排除剂量效应，我们想知道低剂量(100nm)的flg22配合细胞消融，会不会在邻近细胞造成MAMP响应。我们发现，在施用100nm的flag22处理后，在无损伤的伸长区只看到了少量的MAMP诱导响应(F2CD)，但是如果破坏伸长区的表皮细胞，其皮层细胞的MAMP响应加强，这一点与已分化的根相似(F2ABCD)。因此作者推测，损伤诱导的邻近细胞MAMP响应的增强可能发生在整个根部。
Presence of DAMPs Alone Are Not Suffificient to Induce MAMP Responses
到这里，作者想，会不会是cell damage产生的DAMPs引起了邻近细胞的MAMP响应。于是作者选取了几种经典的DAMPs，如AtPEP1,ATP,Cellobiose,OGs,以及被cocktail处理过的上述四种DAMPs的混合物。每种DAMPs分别与flg22混合后处理发现，即使使用高浓度的DAMPs也不能诱导强烈和持续的flag22响应。[EZ出现荧光是因为高浓度(1um)flag22处理会引起MAMP响应，不需要cell damage].AtPEP1是个例外，只能引起DZ区微弱的FRK1响应，而不是PER5响应。这就说明，邻近细胞感知damage信号比作者想象的要复杂，并不是通过DAMPs，可能通过离子和渗透物的释放或其他的机械压力。
MAMP Receptor Expression Is Induced by Cell Ablation and Is Suffificient to Induce Responsiveness
作者发现，在FLS2过表达材料中，施用flg22处理能在已分化的外部根细胞层观察到flg22的响应(F4A)，这也就暗示cell damage引起的邻近细胞MAMP响应是否和PRR表达量升高有关。
我们发现，不管在根的成熟区还是伸长区，FLS2的转录水平在受到损伤的时候被激活(F4,BDFG)。并且FLS2在时间和空间的上调程度与观察到的MAMP(FRK1和PER5)的响应模式一致(F2ABCD与F4BCDF对比)。从F4E中，在受到cell damage和施加flag22后，我们发现FLS2的局部表达水平升高。作者想知道是否FLS2的激活和MAMP响应有关，发现在用相同flag22和cell damage处理的情况下，邻近MAMP响应的细胞和FLS2激活的细胞一致(F4HI)。这也就说明，cell damage诱导了PRR的高表达，并且足够去引起MAMP响应。
Casparian Strips Compartmentalize flg22 Responses in Differentiated Roots
(sgn3-3凯氏带缺失突变体，外界物质可直接进入中柱鞘细胞。F5AB均为已分化的区域)
FLS2在中柱鞘细胞高表达，但在sgn3-3的成熟区，施加flg22没有观察到flg22的响应，但是在过表达FLS2材料中，施加flg22，在sgn3-3中观察到了flg22响应，野生型中却没有(F5AB,红色箭头处表示中柱鞘细胞，由于凯氏带的阻挡，PI并不能对其染色)。这个结果说明凯氏带能够区室化免疫感知。在WT中，FLS2的量并不能够引起MAMP的响应，但是强启动子却可以(F5.AB 3rd column)。
Suberin Lamellae Interfere with flg22 Perception in the Endodermis
sgn3:凯氏带在延伸起始后25细胞期不连续
esb1:凯氏带在延伸起始后25细胞期不连续，内胚层提前栓质化。
ABA-treated:内胚层提前栓质化。
凯氏带功能是阻止外部物质进入中柱细胞，而内栓层(一种次级细胞壁修饰)，最终围绕在整个内胚层并且抑制了内胚层的分子吸收，因为疏水性的内栓层不允许来自细胞壁的分子进入内皮层的细胞膜(F5,CD)。
我们发现早期分化的内皮层(开始延伸后的25细胞期，没有栓化)在FLS2过表达材料中表现出对flg22的响应，但在后期内皮层细胞(开始延伸后的55细胞期，栓化)没有表现出对flg22的响应。(F.5E,2nd column)在esb1和ABA-treated中，flg22的响应在早期的内胚层被抑制，展示出细胞保护性的提前栓质化使得FLS2无法与flg22结合(F.5E)。即使是在根部成熟区，破坏表皮和皮层，这种现象(内胚层提前栓化导致的FLS2与flg22隔绝)(F.5F)也同样发生。
Cell Damage Activates Expression of Multiple Pattern Recognition Receptors
做完一个受体的机制后，作者就想把机制扩大，接下来找到了三种PRR，EFR,CERK1,RLP23.作者观察到，在cell damage情况下，这三种受体的都出现上调表达，这就揭示了cell damage介导了一种十分普遍的应对MAMPs时的上调响应。(F6AB)
做完经典的LRR domain的受体，作者又想在非经典的受体上是否还适用呢，如LORE(LIPOOLIGOSACCHARIDE-SPECIFIC REDUCED ELICITATION)。相似的是，在早期分化的细胞被破坏后，LORE的表达也被强烈诱导，并且施加其配体也主导了在伸长区MAMP的响应，而不是在成熟区，这一点与flg22相似(F6D)。这就把这条机制延伸到了其他PRR.
Local Gating of Immune Responses by Damage in Root-Bacteria Interactions
刚刚都是细胞学试验，最终还是要落实到实际情况上。使用有益菌(CHA0)进行根部侵染，作者观察到，尽管在根部有较强的定植，但在没有受到破坏的已分化根部没有观察到MAMP响应，与细胞学试验类似的是，在侧根原基形成的邻近细胞(自发破坏)观察到了MAMP响应，过表达FLS2并不需要cell damage就能引起MAMP响应(F7A)。当细菌侵染与细胞消融结合起来时，邻近破坏位点的细胞在有细菌存在时展示出对MAMP的响应(F7BC)。【细菌提供了各种ligand】
作者接下来使用对根际有害的菌,GMI1000，GMI1000最初的侵染并不会造成细胞破坏和强烈的MAMP响应，但是继续侵染会造成一些表皮细胞死亡，这个时候就能在邻近细胞观察到局部的MAMP响应升高(F7D)。在FLS2过表达材料的成熟区中，不管用flg22处理(F4A)还是有益菌侵染(F7A)都展示出MAMP响应和低的菌生长量(F7A,E)。这里有意思的是，有害菌GMI1000的flagellin并不能激活拟南芥的FLS2受体。
作者提出的模式图见F7F，就不赘述了。
Inspiration for me
1.把试验做细，大框架已经建好，细节见成败。
2.多做近似相等，比如，A=B,B=C,那么A=C。
3.每一步试验都需要做，不能偷懒且想当然，毕竟生物体这么复杂~