革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
1、涂片固定。
2、草酸铵结晶紫染1分钟。
3、蒸馏水冲洗。
4、加碘液覆盖涂面染约1分钟。
5、水洗，用吸水纸吸去水分。
6、加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
7、蕃红染色液（稀）染1分钟后，蒸馏水冲洗。干燥，镜检。
扩展资料：
革兰染色反应的原理：
革兰染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色。
革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
1。 涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，从酒精灯外焰穿过，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。
拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
2。 干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。
3。 固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。
4. 染色：
（1）初染： 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染： 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色： 将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒，立即用水冲净酒精。
（4）复染： 用番红液染1—2分钟，水洗。
5. 镜检： 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
6. 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应
2.干燥
3.过火
4.初染:用草酸铵结晶紫染色1－2min。用水清洗，再用吸水纸洗掉多余的水。
5.媒染:用碘液染色1min，用水清洗，再用吸纸洗掉多余的水。
6.脱色:用95%的酒精脱色20－30s，用水清洗掉多余的酒精。用吸水纸洗掉多余的水。
6.复染:用番红染液染色2min，用水清洗掉，再用吸水纸洗掉多余的水。
7.镜检
微生物实验 革兰氏染色视频-1（新冠病毒肺炎疫情期间专用）