在无菌操作过程中，进行操作环境及重复使用器械的及时消毒也是极为必要的，这就会用到酒精灭菌和火焰灭菌两种技术。
操作者的手在操作过程中应保持无菌。酒精灭菌是一种很有效的方法：首先用抗菌剂把手洗净，然后在手上喷洒70%（体积分数，以下同）的酒精。
超净工作台在用之前也要用70%的酒精喷洒消毒。操作所用器械尽管已经经过干燥或蒸汽消毒，但操作过程中对其重新消毒也是必要的。在超净工作台中，器械首先用70%80%的酒精浸泡，然后置于酒精灯上烧。
这种火焰灭菌方法可以在操作过程中反复使用。另外，要注意以下几点：操作者最好不要在通风橱中讲话；材料的放置不应改变空气流通的方式；在一个操作过程完成之后，培养容器应尽快封好。