葡萄卷叶病毒病是怎样检验与检疫的?

如题所述

鉴别寄主:

(1)木本指示植物。将被检测植株的芽嫁接到指示植物上生物学检测,是目前最可靠的方法。木本指示植物有葡萄品种蜜笋Mission、黑比诺PinotNoir、品丽珠CabemetFrance、赤霞珠CabemetSauvignon、LN33等,表现为明显的卷叶症状,一般需要1~3年的时间(王艳红,1996)。此外,也可使用巴柯22A(Bacco22A)、Mission和LN-33。

(2)草本鉴别寄主。

目前仅发现汁液摩擦接种可侵染本氏烟N.benthamiana,1~2周后其叶脉出现淡黄色症状(冯建荣,2002)。

血清学检测:简便快捷,在生产中应用最为广泛。酶联免疫吸附检测(ELISA)其灵敏度可达0.1~10ng/ml,而且整个过程可以在数小时内完成。目前最主要的血清学检测技术主要有双抗夹心法和间接法等。抗体是血清学检测的基础,目前已经制备出了GLRaV-1至8的多克隆抗体(MartelliGP,2003;MonisJ,2000)和GLRaV-1,2,6,8单克隆抗体(Huetal,1990b)。在我国蔡文启等首次提取了GLRaV-3的病毒粒子,并制备了GLRaV-3的兔抗血清。运用ELISA在葡萄组织中检测到了GLRaVs(蔡文启等,1997)。

分子生物学检测:GLRaVs检测正在从传统的生物学检测向分子生物学检测方向发展。生物学检测结果可靠性强,但是,检测周期长,费时、费力。血清学检测需时间短,操作简单,但是,必须要有合适病毒的特异性抗体。同时,在血清学检测中,由于植株内部病毒含量低或者有非特异性物质干扰,检测结果可能出现假阴性或假阳性现象。分子生物学检测灵敏度高,但是操作复杂,检测成本高,不能大规模运用。目前在生产中应用最为广泛的是以血清学检测为主,其他检测技术辅助验证的方法。近年来多种GLRaVs的单克隆抗体的制备极大的提高了GLRaVs血清学检测的可靠性。

分子生物学检测主要有dsRNA电泳技术,分子杂交和PCR检测技术。

(1)dsRNA。电泳技术感染GLRaVs的植株内会形成复制型RNA,以dsRNA形式富集(Rezaianetal.,1991)。特定的病毒其dsRNA的基因组和亚基因组具有固定的带型,而在正常植株内不会产生(李东栋,等2000)。dsRNA对酶具有一定的抗性,相对于提取病毒RNA来说提取dsRNA容易操作,通过检测dsRNA的带型和大小就能确定病毒种类(周雪平,李德葆,1995)。牛建新等利用dsRNA检测出了葡萄卷叶相关病毒和扇叶病毒,并指出dsRNA分析不受品种的影响,比生物学方法更加实用(牛建新和李东栋,2002)。

(2)分子杂交。分子杂交一般有斑点杂交、原位杂交等,具有特异性强,灵敏度高的特点。1994年,Saldarelli等用地高辛标记cDNA作探针检测出了GLRaV-3,灵敏度可达125pg(Saldarelli,1994)。

(3)PCR检测技术。PCR检测技术是根据已知病毒基因组的序列设计特异引物,经反转录后,在耐热多聚酶的作用下扩增出特定的DNA片段。PCR检测技术可以检测到极其微量的病毒,极大的提高了病毒检测的灵敏度。随着分子生物学的发展将成为病毒检测的重要手段(Jenniferetal.,2001)。

电镜观察:在感染GLRaVs的葡萄植株中,病毒主要聚集在韧皮部组织内(Castellanoetal.,2000),采用超薄切片在电镜下观察可见病株维管束退化,筛管消解,伴胞与薄壁细胞坏死,线粒体、叶绿体退化,并形成泡状内含体(王国平等,1993)。

检疫危险性评价:本病的病原葡萄卷叶伴随病毒可通过葡萄的繁殖材料进行远距离传播,并可通过多种粉蚧在田间传播扩大蔓延,严重影响葡萄产量和品质。国内已局部发生。季良进行危险性评价时,危险度值10分,为高危检疫性有害生物。

地理分布:世界各葡萄种植区。

检疫国家地区:新西兰、澳大利亚、印度尼西亚、秘鲁、英国、比利时、意大利、匈牙利、荷兰、罗马尼亚、阿尔及利亚、冰岛、摩洛哥、斯洛伐克、乌拉圭、新加坡等。

应检植物:葡萄繁殖材料。

检疫措施:进口葡萄繁殖材料时要求附有出口国《检疫证书》,保证不带此类病毒。入境后经检验,确认无病后才允许用于生产种植。

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