引物设计和探针设计有什么区别

如题所述

引物设计和探针设计(即荧光探针)有3点不同,相关介绍具体如下:

一、两者的用途不同:

1、引物设计的用途:用于PCR扩增技术。

2、探针设计的用途:用于标记待定的核苷酸片断,用与特异性地、定量地检测核酸的量。

二、两者的实质不同:

1、引物设计的实质:一小段单链DNA或RNA,在核酸合成反应时,作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。

2、探针设计的实质:在紫外-可见-近红外区有特征荧光,并且其 荧光性质(激发和发射波长、 强度、寿命、 偏振等)可随所处环境的性质,如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。

三、两者的原则不同:

1、引物设计的原则:

(1)长度:15—30bp,其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度),从而降低产物的特异性。

(2)G十C含量:应在40%一60%之间,PCR扩增中的复性温度一般较Tm值低等于引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时,其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。

(3)碱基分布的随机性:应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C,否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。

(4)引物自身:不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。

(5)引物之间:两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠。

(6)上下游引物的互补性:一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

(7)3’末端:如果可能的话,每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

(8)引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。

2、探针设计原则:

(1)靶基因的确定:选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性(漏检)。

(2)检测片段的确定:选择检测组内的保守(突变少)(避免假阴性)、组间特异的序列(突变多)(避免假阳性)作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。

(3)引物:长度17-25bp;GC含量30-80%;退火温度(Tm值)58-60℃;避免稳定的引物二聚体(特别是多联检测)及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m);序列不能出现连续的G,3’端避免G或C,最后5个碱基内避免两个以上的G或C。

(4)探针:长度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB);GC含量30-80%;Tm值为68-70℃;避免稳定的二聚体及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m);5’端不能是G;位置尽量靠近上游引物;选择波长差异较大(多联检测)或Fam(单联检测)的荧光标记。

参考资料来源:百度百科-引物设计

参考资料来源:百度百科-引物设计原理

参考资料来源:百度百科-荧光探针

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第1个回答  2020-01-14
引物是用来扩增片段用的,而探针,探针上面有荧光基团,完整时检测不到荧光,与两引物之间的目的基因结合,PCR扩增过程中,探针被切断,可以检测到荧光。扩增得到的目的基因越多,那么探针被切断的也越多,检测到的荧光也越多,所以常用来做定量PCR。
第2个回答  2020-05-19
如果你做的事荧光定量pcr,其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的,只是要更加注意引物二聚体、pcr产物大小等问题。染料法不需要其他东西,探针法还需要taqman探针,这个探针的设计是比较有讲究的,并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计,一般使用相关软件进行。
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