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如何把pcr产物克隆到t载体上去
如题所述
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第1个回答 2015-09-28
利用微型仪器
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T载体克隆
的实验过程
答:
试剂
T 载体
,T4 DNA 连接酶,连接酶缓冲液,无菌dd Water操作步骤
PCR产物
与
T载体
直接连接:(1) 事先将干式恒温仪(或冰盒里的水)温度设定在14~16°C。(2) 取4个灭菌的200ul微量离心管,加入:(需要调整)4ul 目的基因1ul T载体0.5ul T4 DNA连接酶(TAKARA, 350U/ul)1ul 连接酶...
pcr产物
回收与
载体
连接的应用
答:
1. 传统方法
,也是最经典方法.利用常规taq酶在pcr产物3'末端多加上一个碱基A的特性,开发出3`末端突出一个T的线性化T载体。从而利用DNA分子AT互补配对进行连接提高克隆重组效率。2.拓展应用的方法。高保真DNA聚合酶没有在产物末端加多余A的功能,可以考虑反应完成后向产物加入适量常规taq酶,将平末端pcr...
简述用
T
-
克隆载体
进行
PCR产物克隆
的原理
答:
T克隆
的原理是基于常规PCR反应中所使用Taq聚合酶能够在
PCR产物
的3‘末端非特异性添加一个A,这样实际上常规PCR产物都含有3端突出一个A的粘性末端。基于这个原理,常规的线性T-
克隆载体
(PUC18和PUC19等)在其3’末端添加一个T,这样的载体能够和任何PCR产物进行连接克隆,并不需要添加任何特异性的粘性末...
pfu聚合酶做
PCR的产物
不加A尾可以TA
克隆
吗
答:
如果使用普通的T载体是不行的,必须要加A
,但是有的公司,比如全式金公司的blunt T载体,它是平端的。可以直接连接这种平末端的PCR产物而不需加A。否则,你就只能加A,体系:0.2ul的taq,1ul的dATP(或者dNTP),1×buffer(例如10×的buffer 1ul),7.8ul纯化后的PCR产物,72℃ 10min即可。
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