硝化细菌与反硝化细菌及其在水产养殖业的应用
硝化细菌与反硝化细菌及其在水产养殖业的应用
王玉堂 全国水产技术推广总站
近年来，硝化细菌在水产养殖业上应用越来越引起人美注意，从而引发了较为广泛的研究。可以说，迄今为止，在大规模集约化养殖生产中，大都使用硝化细菌来净化水质。因为在集约化的水产养殖系统中，经过长期的大量积累，水生生物排泄物等有机污染物甚至动物的尸体较多，在异养性细菌的分解作用下，其中的蛋白质及核酸会慢慢分解，产生大量的氨氮等对水产养殖动物有毒有害物质。氨在亚硝化细菌或光合细菌作用下转化为亚硝酸盐，亚硝酸与一些金属离子结合形成亚硝酸盐；而亚硝酸盐有可和胺等物质结合，形成具有强烈致癌作用的亚硝酸胺。因此，亚硝酸盐常与氨氮相提并论。由于亚硝酸盐长期蓄积，致使养殖水生动物中毒，导致鱼、虾等抗病能力下降而受到各种病原体的侵袭。但亚硝酸盐在硝化细菌的作用下，可转化为硝酸厚，很容易形成硝酸盐，从而成为可以被植物吸收利用的营养物质。
目前市售的一些据称有硝化作用的异养菌或真菌，虽然也能将氨氮氧化成硝酸盐，但通常只能利用无机碳源，其对氨的氧化作用也有十分微弱，反应速率远比自养性硝化细菌慢，不能被视为真正的硝化细菌。硝化作用必须有全自养性硝化细菌来完成。
养殖池塘中的氨氮原本很适合于硝化细菌的生长，但因养殖池中存在大量的异养菌，受异养菌的排斥作用影响，适合硝化细菌栖息的地方相对于自然环境而言显然少得多，因此，没有足够数量的硝化细菌来消费过来的亚硝酸盐，就是问题所在。
一、硝化细菌及其生物学
1、 硝化细菌
硝化细菌是指利用氨或亚硝酸盐作为主要生存能源，以及利用二氧化碳作为主要碳源的一类细菌。硝化细菌是古老的细菌群之一，其分布广泛，土壤、海水、淡水及污水处理系统中都有存在，但在一般环境少有出现，因为其分布会受到很多环境因素的限制，入氨源、温度、氧气浓度、渗透压、酸碱度和盐度等
硝化细菌分为硝化细菌和亚硝化细菌。亚硝化细菌的主要功能是将氨氮转化为亚硝酸盐；而硝化细菌则主要功能是将亚硝酸盐转化为硝酸盐。氨氮和亚硝酸盐都是水产养殖系统中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强致癌物质。因此，如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。由于亚硝化细菌的生长速度较快，且光合细菌也具有降解氨氮的作用，因此，现代水产养殖已能成功的将氨氮控制在较低水平上。而对于亚硝酸盐，由于自然界中的硝化细菌生长较慢，且还没有发现其他可替代的任何微生物，所以养殖过程中产生的亚硝酸盐就成为阻碍养殖业发展的关键因素。科学人员经过长期的努力，目前已能通过大量的实验筛选，最终研究出一种新型的纯硝化细菌——硝化宝，他能有效地将亚硝酸盐降低至规定的浓度范围。
2、硝化细菌制剂的生物学特性
生物的生长和繁殖除需要可用于构建自身细胞成分的基本物质外，也需获得能量。硝化细菌是一种化能自养菌，是利用无机物质获得能量的。硝化细菌利用亚硝态氮获得合成反应所需的化学能量，在体内制造糖类；而制造糖类所需的时间相当得长，不像其他异养性细菌从有机物中直接分解及摄取所需要的糖类，因此，硝化细菌的生长和繁殖速度远比一般异养性细菌慢，在自然条件下，硝化和脱氢效果不能满足正常养殖的需要。温度、酸碱度和水体中的溶解氧浓度对硝化细菌的生长均有重要影响。
硝化细菌剂——硝化宝是取自海洋中硝化细菌，经过特殊工艺筛选而得到的硝化能力极强的纯化硝化细菌菌株，其适应生长温度为10℃-37℃，适应的PH为6.5-8.5。硝化细菌形态较小，接种到肉汤培养基上不能正常生长，是严格的自养型微生物，是以氧化无机物产生的化学能为能源，并利用外来的能量，以二氧化碳或者碳酸盐为碳源合成细菌本身的有机物，能直接分解和利用亚硝酸盐。其主要特征是自养性，生长速度低，好氧性，依附性和产酸性等。硝化细菌是生物脱氮过程中起主要作用的微生物，水体中硝化细菌数量直接影响到硝化效果和生物脱氮反应效率，硝化细菌制剂的浓度与硝化率成正比。
二、 硝化细菌制剂—硝化宝的制备技术
硝化细菌制剂——硝化宝是采用现代生物工程技术，配合国际先进的生产，检测设备，能够大规模培养生产出可用于水产养殖业的高活性硝化细菌产品。产品的制备技术包括硝化高效连续富集培养技术，定向驯化技术，大规模制备技术和先进的制剂技术。
1、 硝化细菌的高效富集培养技术
富集培养又称强化培养，是指在基础培养基中加入特殊养分，使难于在一般培养基上生长的菌种能生长的一种培养方法。由于在自然界中存在的硝化细菌，其硝化率极低，不能直接用于养殖池塘水体的亚硝酸盐降解。所谓高连续富集培养技术，是指筛选和富集高效硝化细菌的方法，既采用世界上先进的德国进口生物技术设备，在无菌条件下从自然界中连续富集能降解亚硝酸盐的硝化细菌。该技术是根据科研工作者的需要，采用含高浓度的亚硝酸盐体系，将小到微米级的高效硝化细菌收集起来。所以，采用这种技术获得硝化细菌据偶很强的降解亚硝酸盐的能力。
2、 硝化细菌的定向驯化技术
获得了亚硝酸盐降解能力强的高效硝化菌后，科研人员通过定向驯化技术，以使收集到得硝化细菌能在自然条件下快速生长和高效降解养殖池塘中亚硝酸盐。研究过程中，首先要对硝化细菌的生长速度进行驯化，将生长速度低的硝化细菌不断地淘汰，最终获得生长速率快的优良菌种，这一过程能保证硝化细菌在养殖池中进行快速生长和繁殖，并保持一点的数量级。在此基础上，低硝化细菌的亚硝酸盐降解能力进行驯化，获得能快速降解亚硝酸盐的优良菌种，这一过程又保证了硝化细菌将养殖池塘中的大量亚硝酸盐降低到适应浓度或含量，即驯化后的硝化细菌其所谓的“吃亚硝酸盐”的能力或大幅度的提高。
此外，科研人员采用定向驯化技术，使用高效硝化细菌的适应能力大幅提高。定向驯化技术还保证了硝化细菌在不同的温度和不同的酸碱度条件下能保持快速生长和繁殖及降解亚硝酸盐的能力，为高效硝化细菌的大量使用奠定基础。
3、 硝化细菌的大规模培养技术
将通过高效连续富集技术和定向驯化培养技术运用而获得的高效硝化细菌应用于水产养殖中，产品的成本和品质是关键因素。而硝化细菌的大规模培养技术则是解决这一问题的重要一环。科研人员采用德国进口的培养设备和现代生物工程技术相结合，最终研制出大规模高效硝化细菌的培养技术工艺，在培养温度控制、营养物质添加、溶解氧浓度和酸碱度的全自动等方面进行了详细的研究。实验结果表明，高效硝化细菌产品的生长速度快、适应能力强、硝化降解能力强、硝化细菌浓度高等优点。
4、 硝化细菌高品质产品制备技术
微生物在液体中很难长时间的生存，这一点是人所共知的。要使硝化细菌产品走向市场，其制备技术及其重要。为此，科研人员在采用进口设备和选择先进工艺的同时，还以物理方法使硝化细菌处于“休眠”状态，再进行干燥而得到干品，然后配以保护剂、吸附剂等制的硝化细菌的制剂产品，以最大程度的保持硝化菌的活性和活力，最后采用无氧包装。这一产品的特点是保存时间长，活化率高。硝化细菌的制剂技术最终实现了规模化和工业化生产，为水产养殖业的大规模应用提供了保证。
三、 硝化细菌的作用机理
1、 氮循环与循环过程
（1） 氮循环
氮循环是指氮在有机体与环境之间的循环，是一个复杂的反应过程，主要是指有机氮与无机氮之间的相互转换的过程。
（2） 循环过程
氮循环的基本过程为：含有氮有机物→氨氮→亚硝酸盐→硝酸盐
上述过程也能逆转或反向进行称为反硝化作用。该过程能将一部分硝酸盐还原为氨，一部分硝酸盐分解成氮气而进入大气中。这个循环过程中的中间产物—氨氮、亚硝酸盐是有毒有害物质，而硝酸盐是无毒无害的且硝酸盐能被动植物及藻类加以吸收利用。
2、 氮循环过程对于水产养殖业的意义
了解和掌握了氮循环过程，就可以利用自然界所固有的规律，降低水产养殖水体中所产生的氨氮和亚硝酸盐含量，改善水体，减少或降低氨氮及亚硝酸盐对水产养殖动物的危害，确保养殖生产安全。硝化细菌制剂就是利用这一原理，通过消耗细菌的降解氨氮和亚硝酸盐作用，将亚硝酸盐等转化成硝酸盐为目标而制备的一类产品。
3、 作用机理
硝化细菌的硝化作用有时特称为硝酸化作用，因为它能产生如下反应：
NO-2+1/2O2→NO3-+17.8Kcal.mol-1
上述反应中，氨由正三价氧化为正五价，并产生17.8千卡每摩尔的热量。这些热量用于形成ATP并储存其中，从而使硝化细菌可以同化二氧化碳所需的能量。硝化细菌制剂利用这一能量有机物，其反应为：
6CO2+6H2O→C6H12O6+6O2
这种由硝化细菌制剂完成的生物氧化作用称为自养性硝化作用，即硝化细菌在好氧条件下，利用其化学能自养的生长特性，将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，并从中获得赖以生存的化学能，用于固定二氧化碳来满足其对碳的需求。
4、 硝化细菌的硝化作用强度检测
（1） 实验室实验
将硝化细菌接种到液体培养基中，在24摄氏度条件下培养5天；取出1ml培养液稀释100倍（视培养液中的二氧化氮浓度而定），加入格利斯试剂，在752分光光度计上进行比色；通过检测亚硝酸根的减少量，可以判断硝化细菌的硝化作用。一般硝化细菌经过10左右时间的发酵培养，可使发酵液中的亚硝酸盐离子浓度下降40%左右。
（2） 田间实验
为验证硝化细菌降解养殖水体中亚硝酸盐的作用，科研人员在广东省湛江市东海岛对虾养殖场进行了田间实验。
时间为2003年10月16日~11月3日。
实验池:面积4亩，平均水深150cm，水温24-25摄氏度，池塘底部铺设地膜，有排污设施，配2台水车型增氧机、5台潜水型增氧机；虾苗放养时间为为6月24日，放苗密度为10万尾/亩，虾苗规格和1CM左右；实验期间为10月16日，此时的对虾平均规格为11cm，池塘中亚硝酸盐浓度为2.97PPM；实验期间只在10月16日泼洒一次硝化细菌制剂，用量为1ppm。实验情况如下：
2003/10/16 2.937
2003/10/17 2.863
2003/10/18 2.771
2003/10/19 2.726
2003/10/20 2.618
2003/10/21 2.510
2003/10/22 2.479
2003/10/23 2.434
2003/10/24 2.266
2003/10/25 2.278
2003/10/26 1.986
2003/10/27 1.644
2003/10/28 1.495
2003/10/29 1.259
2003/10/30 1.200
2003/10/31 0.847
2003/11/01 0.587
2003/11/02 0.541
2003/11/03 0.400
实验表明，在虾池中施入硝化宝后，在未换水的情况下，经过19天，亚硝态氮下降了98.6%，且对虾生长情况良好。
四、 硝化细菌施用注意事项
由于硝化细菌的生物学特性与其他细菌有所不同，使用时不需要经过活化处理，不需要用葡萄糖、红糖等来扩大培养，反之会使硝化细菌失活，因此，使用时只要简单的用池塘水溶解后全池泼洒即可。
因硝化细菌的特点是繁殖较慢，20多小时才能繁殖一代，不像芽孢杆菌那样2分钟就能繁殖一代，所以施用硝化细菌后，一般情况下需要4-5天后才能发挥明显的效果，因此提前施用时间久石非常重要，为更好的发挥硝化细菌的作用，在实际应用中，若芽孢杆菌和光合细菌一起施用时，硝化细菌应提前几天施用，避免繁殖速度慢而被其他活菌抑制生长和繁殖。
硝化细菌不可与化学增氧剂入过碳酸钙或过氧化钙同时使用，因这些氧化剂在水体中放出氧化能力较强的氧原子会杀死硝化细菌，所以，最好是在施用氧化剂1天后再施用硝化细菌。
由于硝化细菌是吸附在有机物上，在高位池中采用的中间排污，会排走大量的硝化细菌，特别是硝化细菌刚投放的前几天，硝化细菌的繁殖尚未进入高峰期，这时排污会使硝化作用不明显。因此，在高位池中，最好使用硝化细菌4-5天内基本不排污或少排污。在施用硝化细菌时，如结合使用质量好的沸石粉同时泼洒，使硝化细菌能够快速的沉入池塘底部而不易被排走，效果会更佳。
养殖池塘内的酸碱度和溶解氧含量与硝化细菌的使用效果有直接的关系。硝化细菌对PH值的适用范围为5~10，但在低于7或高于8.5的水体中，硝化细菌的繁殖会受到一定的影响，最适宜的pH值范围是7.8~8.2，同时，硝化细菌在将氨氮转化为亚硝酸盐的过程中，是一个消耗氧的过程，但需氧量很少，在使用硝化细菌的水体中，溶氧只要不低于2mg/l即可。
纯化硝化细菌的保存和包装工艺，是决定其使用效果和保存期限的重要因素，因此，载体须使用200~300目以上的特殊物质，且其含水量不高于5%，并采用无氧包装。
五、 硝化细菌与反硝化细菌在水产养殖中的应用
1、 反硝化细菌的作用
亚硝酸盐对人和许多生物具有毒性。其对鱼类的致死浓度及毒害机理为主要是亚铁蛋白被氧化成高铁蛋白，从而抑制血液的载氧能力，严重是导致死亡。在水产养殖业中，水体中的亚硝酸盐浓度高时引起鱼虾死亡的直接或间接原因。而反硝化细菌被证明对亚硝酸盐有很大降解的作用。
（1） 反硝化细菌的生长特征
反硝化细菌中一类能利用亚硝酸盐为氮源、有机物碳为碳源，并能进行自身繁殖的微生物，通常同伴利用氮、碳源的比例为1：7，即消化一分子氮元素需要7分子的碳元素。入1库存水面的养殖水体按1000吨、亚硝酸盐含量为0.5ppm,相当于亚硝酸钠2500g，需要消耗碳源相当于葡萄糖25Kg。
芽孢杆菌是一类对有机物分解很强的微生物，氮不能有效利用亚硝酸盐。目前关于芽孢杆菌具有降解亚硝酸盐的宣传，是基于其降解有机质而间接抑制亚硝酸盐的产生，而实际是亚硝酸盐一经产生，芽孢杆菌就无法降解。反硝化细菌则是专一利用亚硝酸盐的微生物，在利用亚硝酸盐的同时需要利用有机物，氮对有机质的降解能力不如芽孢。
合理使用反硝化细菌和芽孢杆菌是调水的一项技术，当水质受到污染时，先用反硝化细菌将亚硝酸盐降解掉，然后利用芽孢杆菌或粪链球菌净化水质，会起到优势互补的效果。
（2） 反硝化细菌在水产养殖业的利用
据试验表明，不同亚硝酸盐含领队水体所需的反硝化细菌用量有所不同，在适宜条件下，0.7ppm的用量在72小时后可以将亚硝酸盐喊了从0.3ppm降到0.1ppm以下；同时，pH、水温对亚硝酸盐的降解有一定的影响，以pH6~7、水温25~30时的作用最为明显，固定反硝化细菌的脱氮效率较高，且对外界理化因子有较强的抵抗能力。
目前影响反硝化细菌在水产养殖中发挥作用的几种情况大致如下：一是水质清瘦。养殖水体水质要求一般是活、嫩、清、爽，因渔民误解为芽孢杆菌具有降解亚硝酸盐的能力，而大量使用，结果是养殖水质变得清瘦，而亚硝酸盐却没有降解。在这种情况下，即使使用反硝化细菌，也很难起到很好的效果。因反硝化细菌需要丰富的营养才能繁殖，而芽孢杆菌已经将营养缩减消耗，同时与反硝化细菌继续竞争养分而抑制了反硝化细菌的生物繁殖。二是重金属离子浓度较高。养殖池塘中本身重金属离子浓度较高，再加上经常使用硫酸铜等含重金属的消毒剂，使池塘中重金属离子浓度更高，而抑制了反硝化细菌的繁殖，从而起不到降解亚硝酸盐的作用，或作用较小。三是消毒剂的使用。因反硝化细菌是活体，当施用消毒剂、杀虫剂后而其毒性未消失前使用反硝化细菌的效果会很差，最好是隔5天后使用反硝化细菌。四是增氧剂和反硝化细菌同时使用。增氧剂主要有过碳酸钙、过碳酸钠和双氧水等，他们释放氧气的同时，对微生物的杀灭作用也较强。增氧剂有增氧和降解亚硝酸盐的作用，其降解亚硝酸盐的原理是其释放的原子氧将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，而硝酸盐又很快被还原成亚硝酸盐，很难起到去除亚硝酸盐的作用。
2、 硝化细菌的应用
李长玲等人进行了“硝化细菌改善鱼苗培育环境增强罗非鱼抗逆性的研究”。通过人工引入硝化细菌与罗非鱼养殖环境中，检测主要水质因子，并测定罗非鱼对主要环境因子的抗逆性。研究微生态调控对水质改善和对罗非鱼看抗逆性的影响。结果表明，引入不同浓度的硝化细菌能显著改善罗非鱼鱼苗培育阶段的水质，提高罗非鱼的抗逆性。硝化细菌浓度在100cfu/L时氨氮含量相对于对照组降低了25.05%，亚硝酸氮含量浓度降低了45.16%，COD值降低了12.33%,显著低于对照组；鱼苗培育成活率相对于对照组高7.58%，体长增长22.18%，体重增加46.15%，显著高于对照组；在氨氮、亚硝酸盐、pH、温度、耐氧抗逆性实验条件下，幼鱼的成活率分别为80%、100%、80%、80%和82.5%，缺氧死亡一半的时间为601秒，均高于对照组。
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