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T载体克隆
T载体克隆
实验过程
答:
以下是
T载体克隆
实验过程的改写内容:实验一:目的基因与载体连接 所需器材:旋涡混合器、微量移液器、离心管、离心机、干式恒温器 试剂:T载体、T4 DNA连接酶、缓冲液、无菌dd Water 步骤: 设定恒温器至14~16°C。 准备10ml连接液,包括4ml目的基因、1ml载体等。 轻轻混匀后离心,置于...
什么是
T载体
?T载体分为哪几类?有什么区别?
答:
T载体
又称T-vector。聚合酶链反应产物的克隆运载体,线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸(A),与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。T载体是一种
克隆载体
,也就是用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体,它不能大量表达。多用于克隆...
T载体克隆
实验原理
答:
T载体克隆
实验的原理主要涉及重组质粒的构建、感受态细菌的制备以及β-半乳糖甘酶显色反应的选择法。首先,构建重组质粒是通过DNA连接酶,如T4噬菌体DNA连接酶或大肠杆菌DNA连接酶,将经过酶切的载体与外源DNA片段连接起来。T4噬菌体DNA连接酶可连接粘性末端和平末端,但平末端连接效率较低,通过调整酶浓度...
T载体克隆
实验准备
答:
为了进行
T载体克隆
实验,首先需要进行一系列的准备工作。首先,确保所有的器具清洁,包括5个100ml的锥形瓶(其中一个小的备用),6副培养皿,3个小试剂瓶,以及接种环和涂布棒。接下来,准备100ml的超纯水作为基本溶液。对于实验溶液,需要配置LB培养基300ml,其中液体部分为50ml+50ml,固体部分为100ml。
T载体克隆
试剂配制
答:
要配制
T载体克隆
试剂,首先准备X-gal溶液。将0.02克X-gal粉末用二甲基甲酰胺(DMF,CAS号68-12-2,无色液体,熔点-61℃,沸点152.8℃)溶解,配制成20mg/ml的浓度。将溶液储存在玻璃管或聚丙烯管中,用铝箔包裹以防止光照破坏,并保持在-20℃。注意,X-gal溶液无需过滤除菌,可以直接使用。接...
PGM—
T克隆
是什么
答:
pGM-T是一种
T载体
,可以方便地克隆PCR产物。pGM-
T克隆
就是插入了PCR产物的pGM-T的克隆。T载体是一段线性双链DNA载体,载体的两端3‘末端各有一个额外的T。因为大部分Taq聚合酶会在PCR产物3’末端添加一个额外的A,所以使用T载体可以比较方便且高效(相对于平末端)进行PCR产物的连接反应,以方便克隆...
目的片段如果和
T载体
长度接近,那么还能用t载做
克隆载体
吗?
答:
并不需要添加任何特异性的黏性末端位点.这个就是
T克隆
的原理了.关键是这个黏性末端带的是什么。因为
t载体
的末端是突出的t。如果直接是pcr产物,需要考虑,用taq酶扩增的片段可以直接连,如果是高保真酶扩增的片段,需要用taq酶加a尾,大约30min左右。如果是已经经过酶切的片段,确实要补平加a。
T载体克隆
的实验原理
答:
这样,pUCm-
T载体
的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中,形成含有目的片断的重组载体。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),...
T载体克隆
的实验准备
答:
4管 4 x 5 = 20ul 做4份 目的基因
T载体
T4连接酶 10x冲液 4 x 4uL 4x1uL 4x0.5uL 4x1uL 灭菌:5个100ml锥形瓶(外加1个小的),6副培养皿,3个小试剂瓶,接种环,涂布棒,10ml超纯水,LB培养基,1.5mlEP管,大小枪头,过滤用具2副,,0.1mol/L CaCl2 ...
T载体克隆
为什么要用cDNA
答:
T载体可以克隆任何DNA片段。它的目的是后续测序,以便连接到表达载体表达蛋白,所以多数情况下用cDNA。但是也可以基因组测序分析用,扩增16SrRNA就是基因组扩增后
T载体克隆
测序。。
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