第1个回答 2024-06-12
T载体克隆实验的原理主要涉及重组质粒的构建、感受态细菌的制备以及β-半乳糖甘酶显色反应的选择法。首先，构建重组质粒是通过DNA连接酶，如T4噬菌体DNA连接酶或大肠杆菌DNA连接酶，将经过酶切的载体与外源DNA片段连接起来。T4噬菌体DNA连接酶可连接粘性末端和平末端，但平末端连接效率较低，通过调整酶浓度和DNA浓度可以提高效率。连接过程包括酶-ATP复合物结合DNA、DNA腺苷化和磷酸二酯键形成。
在PCR扩增后的产物中，pUCm-T载体因其3'端带有突出的T，能与PCR产物进行正确的配对并连接，形成重组载体。为了优化连接酶活性与DNA稳定性，连接反应通常在12-16℃进行长时间处理。
细菌制备感受态是通过在0°C低渗CaCl2溶液中失活部分膜蛋白，使其更容易接纳外源DNA。在实验中，β-半乳糖甘酶显色反应的选择法利用了LacZ基因，它的表达状态可以通过X-Gal染色反应来判断。部分质粒带有β-半乳糖核苷酶的调控序列和编码片段，只有当载体进入宿主细胞并受到IPTG诱导时，才能合成完整的酶活性蛋白。外源基因插入会导致lacZ基因表达受阻，而未插入基因的载体则会正常表达，形成蓝色菌斑。