退火温度低会对PCR产生什么影响?

Question

我做菌落PCR，使用一个特异性上游引物和一个T7下游通用引物，退火温度用的是较低的48度，但引物的Tm分别为57，71，阳性对照都没有出结果，请问是怎么回事呢？
退火温度过低对PCR会有什么影响呢？
谢谢～～

Answer 1

通常来说，退火温度是由引物的GC%含量决定的，但是反应体系的条件改变也会影响引物的退火温度（如Mg,Na等离子浓度）。建议你去http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/分析一下你的PCR体系中的引物退火温度，而不是仅仅由公式计算得出。一般情况下，退火温度过低只会导致反应体系中引物与DNA模板的非特异性结合，致使反应结果中出现大量非特异性结合条带。但是，你所需的产物也应该是包含在其中的，如果完全没有结果，说明你反应体系中其他步骤还存在问题，例如扩增时间等比较关键的步骤。

另：不同的hot taq酶对Tm要求也是不同的。例如今年clontech新出了一种十分nb的hot taq酶，它需要的Tm温度是引物Tm温度再高5度。所以，弄清楚你试剂盒的反应条件要求也是很有必要的...

Answer 2

退火温度过低会造成pcr时非特异性带增多，如果退火温度低都pcr不出结果，我觉得可能你的体系有问题，或者引物有问题，pcr温度低只是带比较多，一定会包含目的带的。

Answer 3

当然有影响，这种引物温度差太多的都比较难扩增。
所以建议你提质粒酶切或测序

Answer 4

为什么用48℃退火呢？还有你的引物退火温度71℃？你记错了吧？
你把退火温度升到55℃。