PCR扩增中,降低退火温度、延长变性时间对反应有何影响

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第1个回答 2012-03-30

杂带会增加追问

延长变性时间对反应的影响，也是事非特异性条带数增多吗

追答

一般94度变性，对于扩增长片段，或者GC含量过高的片段，可以适当延长变性事件。但因为酶本身在温度过高时也会逐渐失活，所以不宜过分延长变性时间。这个时间的延长不会导致非特意带增加

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PCR实验 延长变性时间对反应有何影响答：如果在推荐的变性时间之上再延长,这样好像不太好,在95 °C条件下变性30 Sec一般都能够使模板变性.还有你说的变性是指循环的变性还是预变性?有的热启动酶需要预变性时间比较长,一般3-5 min就够了.变性时间延长会导致酶活性的降低.如用Takara的荧光定量PCR试剂盒时,预变性时间为30sec,循环中变性时间为5 Sec. ...

PCR的退火温度对反应的影响答：影响：以文献作参考，在一定的温度范围内，退火温度越高，扩增的特异性也就越高。退火温度越低，扩增产物的特异性也就降低。如果退火温度过高，引物与模板结合差，电泳条带差，甚至没有扩增。如果温度过低，扩增特异性差，杂带较多，背景深。

PCR时的退火时间长短对整个PCR 过程及结果有什么影响么?答：PCR的退火时间要把握严格，太长的话会导致变性的DNA两条链重新连接，影响下面的延伸过程；如果时间过短的话，会导致引物没有与DNA链完全连接，导致延伸失败或复制错配

退火温度低会对PCR产生什么影响?答：一般情况下，退火温度过低只会导致反应体系中引物与DNA模板的非特异性结合，致使反应结果中出现大量非特异性结合条带。但是，你所需的产物也应该是包含在其中的，如果完全没有结果，说明你反应体系中其他步骤还存在问题，例如扩增时间等比较关键的步骤。另：不同的hot taq酶对Tm要求也是不同的。例如今年...

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