T 载体与 目的基因连接成功，测序结果也正确。从新摇菌，提取质粒，在进行双酶切，一直切不下来。

Question

用的是 ClaⅠ ，EcoR Ⅰ 两种酶 体系20
酶切 3小时 过夜 都试过了
期待解决

Answer 1

解决办法：1、cla1是一个比较不常见的酶，可能酶切体系和ECOR1的缓冲体系不一样，试着分别酶切，就是先切cla1，然后纯化后切ECOR1；或者查找哪个酶的酶切效率高些，那个后切；2、3个小时可能太短了，我一般都是5个小时，或者过夜；3、可能是你菌挑错了，或污染了，重新调菌或者把原来构建成功的质粒进行转化，再酶切。希望对你有帮助。追问

我试过单酶切，先用的是cla1 切3个小时 65摄氏度 13分钟 然后再用ECOR1切 3个小时，但是也没有结果啊。
菌估计是不能挑错的 我做的是蓝白斑筛选，挑的单菌落 进行摇菌，提取质粒 拿去一定体积的去测序，剩下的一部分进行酶切。。。。测序的结果显示和GNEBANK上的一样并有我的酶的序列。

追答

我建议还是把你切的质粒用别的酶验证一下，这样更能确定是不是你要的那个片段，比如T载体上的多克隆位点和目的基因上的位点一起切，再确定。先把握是不是你的东西。如果确定是的话，我建议过夜切。另外你可以查一下这个cla1的特性。再一个为什么挑这么一个不常见的酶用呢？如果不是实在没办法不建议用不常见的酶。
另外，你的质粒有可能过多或过少，你通过什么判断切不下来？

Answer 2

可能是你酶的问题哦，加入酶失活了，切一个星期都没用，建议换另外实验室的试一下。

Answer 3

你的引物含有ClaⅠ的酶切位点吗？用载体上的其他酶切位点，双酶切鉴定下看看。也许酶有问题追问

测序分析 有酶的序列啊 。用他来切别的基因片段能切啊。